科研人必备！流式抗体配色原则汇总！

在进行流式实验时，多色抗体染色是常见的需求，为了确保实验的准确性和可靠性，进行流式抗体配色时需要遵循一系列原则。以下是流式抗体配色的主要原则~

1.强弱搭配原则

核心思想：弱表达抗原搭配强荧光染料，强表达抗原搭配弱荧光染料。这一原则有助于在检测时提高信噪比，使弱表达抗原的信号不被强表达抗原所掩盖。
实践应用：在进行抗体选择时，需要查询抗原的表达强弱，并根据这一信息来选择合适的荧光染料。例如，对于高表达的抗原如CD45，可以选择较弱的荧光染料如FITC；而对于低表达的抗原如某些细胞因子受体，则可能需要选择较强的荧光染料如APC。

2.避免荧光溢漏原则

共表达抗原：对于共表达在同一细胞上的抗原，应避免使用会相互干扰的荧光染料。这通常意味着需要选择发射光谱重叠较小的染料组合。如下图，Treg细胞检测中CD25和Foxp3抗原为共表达抗原。

互斥抗原：如果两种抗原在理论上不会共表达在同一细胞上（即互斥抗原），如下图CD4和CD8不会同时表达在同一细胞，则可以允许一定程度的荧光溢漏。这是因为即使发生溢漏，也不会对另一种抗原的检测造成干扰。

亲代和子代抗原：允许子代对亲代的溢漏，比如CD3是亲代，CD8是子代，允许CD8对CD3的溢漏。

3.仪器配置与荧光染料选择

了解仪器通道：在进行抗体配色之前，需要详细了解流式细胞仪的通道配置，包括激光器的波长、滤光片的设置等。这将有助于选择合适的荧光染料，以确保它们能够被仪器准确检测。

荧光素按激发光波长来分，主要是激发波长为375 nm、405 nm、488 nm和633 nm 4类，其中，常用的是激发波长为488 nm和633 nm的荧光素，如FITC、PE、APC、PI等。

荧光染料选择：根据仪器的通道配置和荧光染料的特性（如激发光谱、发射光谱、亮度等），选择合适的荧光染料进行搭配。通常，每种荧光染料都有其特定的激发和发射波长范围，需要确保这些波长范围与仪器的通道设置相匹配。

荧光素亮度搭配原则：低表达量的抗原，推荐使用高亮度荧光素；高表达量的抗原，推荐使用低亮度荧光素。

荧光素之间的光谱重叠最小化：尽量选择光谱重叠小的荧光素组合，如FITC/PE-Cy7；选择不同激光激发的荧光素组合，如FITC/APC、PE/APC。

4.标准化操作与质量控制

标准化操作：在进行多色抗体染色时，需要遵循标准化的操作流程，包括细胞处理、抗体孵育、洗涤等步骤。这有助于减少实验误差和提高数据的可靠性。
质量控制：在实验过程中，需要进行质量控制以确保实验结果的准确性。例如，可以设立阴性对照和阳性对照来监测实验的特异性和灵敏度；同时，还可以进行荧光补偿调整以消除不同通道之间的干扰。

5.其他注意事项

避免使用复合染料：复合染料虽然可以提供更多的颜色选择，但它们容易发生降解和断裂，导致实验结果的不稳定。因此，在可能的情况下，应尽量避免使用复合染料。
考虑自发荧光：某些细胞类型具有较高的自发荧光水平，这可能会干扰荧光染料的检测。在选择荧光染料时，需要考虑细胞的自发荧光特性，并选择合适的激发和发射波长范围以避开自发荧光的干扰。
综上所述，流式抗体配色是一个复杂而精细的过程，需要综合考虑抗原表达强弱、荧光染料特性、仪器配置以及实验操作等多个因素。通过遵循上述原则并注意相关事项，可以确保多色抗体染色的准确性和可靠性。

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