流式实验必备！常见组织样本单细胞悬液制备方法（下）

众所周知，实验的成功往往依赖于高质量的样本制备，对于流式细胞术而言，制备单细胞悬液是确保实验顺利进行的关键步骤。为了进行有效的流式分析，必须将组织分解成单个细胞，并尽可能保持细胞的基本特性和生物学功能。在前文中，小编已经介绍了一些常见的组织样本单细胞悬液制备方法，本文将进一步深入探讨更多相关的技术和注意事项。

一、淋巴组织细胞

1.取出淋巴结，并将其浸泡在干净的PBS溶液中。

2.使用2.5 mL无菌注射器吸取培养液，左手用镊子夹住淋巴结，右手持注射器小心插入并吹打，直到淋巴结内的细胞完全释放，只剩下白色的结缔组织和脂肪组织。

3.将释放出的胸腺细胞通过200目筛网过滤，收集到15 mL离心管中，进行300 g离心5分钟，弃去上清液。

4.使用细胞染色缓冲液重悬胸腺细胞，进行计数，并调整细胞浓度至1×10?个/mL。

二、肠粘膜

（Ⅰ）动物准备：在开始前确保所有操作都在无菌条件下进行。对小鼠实施安乐死，并用70%乙醇消毒腹部皮肤。

（Ⅱ）取材：打开腹腔，暴露并取出整个小肠。用PBS轻轻冲洗小肠以去除内容物。

（Ⅲ）剪碎组织：将小肠放置于含有PBS的培养皿中，使用无菌剪刀将小肠剪成小段（约1-2mm长）。

（Ⅳ）消化：将剪碎的小肠段转移到含有预热至37°C的酶混合物的离心管中，根据酶的活性调整消化时间，一般为15-30分钟。期间需要每隔几分钟轻轻摇晃一次离心管以促进消化。

（Ⅴ）终止消化：消化完成后，加入适量的含有10% FBS的培养基终止酶的作用，然后通过70μm细胞筛网过滤，收集滤液到新的离心管中。

（Ⅵ）洗涤：以1000 rpm的速度离心5分钟，弃上清，重复此步骤2-3次，直到细胞悬液中没有明显的杂质。

（Ⅶ）重悬细胞：最后，将细胞沉淀重悬于适量的培养基中，可以使用台盼蓝染色法检测细胞活力，并通过细胞计数板计数细胞数量。

三、肿瘤组织

（1）将取出的肿瘤置于含有无菌PBS的15毫升离心管中，保持在冰上。样本量不宜超过1755mm3/10ml，若需更多细胞，可混合来自同一患者的5-10只小鼠的肿瘤组织。

（2）使用无菌手术刀将肿瘤组织切成小块，加入10ml 1X解离液，充分混匀后，置于37℃、5% CO2的培养箱中孵育15分钟。

（3）使用25ml吸管轻柔地上下抽吸混合物数次，再用10ml血清移液管进一步帮助组织分散，然后重新放入培养箱。

（4）每隔15分钟抽吸一次，持续3小时，直至得到均匀的细胞悬液。注意，组织孵育时间不应超过3小时，以免影响细胞活力。

（5）将70μm滤网置于50ml离心管上，将10ml细胞悬液通过滤网过滤。

（6）用10ml IMDM（含10% FBS）清洗滤网，确保所有细胞都被收集。

（7）收集的细胞悬液以300g离心5分钟。弃上清后，加入1ml预冷的ACK裂解缓冲液，冰上孵育不超过5分钟以裂解红细胞。

（8）加入10ml PBS洗涤，再次以300g离心5分钟。

（9）最后，将细胞重悬于10ml PBS中，并使用台盼蓝染色法计数活细胞。

（10）制得的单细胞悬液可用于小鼠注射或低温保存。

流式细胞术是一种强大的工具，能够在单细胞水平上进行精确测量，广泛应用于免疫学、癌症生物学等领域。为了确保实验结果的准确性和可靠性，制备单细胞悬液时应尽量减少细胞损伤，提高细胞产率，同时保持细胞的原始特性。菲恩生物凭借其先进的单克隆抗体开发平台，提供了多种高亲和力、高特异性的抗体，适用于多种免疫细胞亚群的检测，包括但不限于Th细胞。这些抗体覆盖了人类、大鼠、小鼠等多种物种，提供了丰富的检测指标选择。

以下是推荐的流式抗体配方方案，用于检测不同免疫细胞亚群

流式抗体推荐
种属	细胞群	流式抗体搭配	货号
Human	T/B/NK细胞群检测	CD45-PerCP	PCP-30039
		CD3-FITC	FITC-30004
		CD16-PE	PE-30061
		CD56-PE	PE-30008
		CD19-APC	APC-30066
Human	Th1/Th2 细胞群检测	CD3-PerCP/Cyanine5.5	PCP55-30004
		CD4-FITC	FITC-30005
		IFN-γ-PE	PE-30053
		IL4-APC	APC-30043
Mouse	Th1/Th2 细胞群检测	CD3-PerCP/Cyanine5.5	PCP55-30002
		CD4-FITC	FITC-30001
		IFN-γ-PE	PE-30074
		IL4-APC	APC-30026
Human	Treg细胞群检测	CD4-FITC	FITC-30005
		CD25-PE	PE-30035
		CD127-APC	APC-30033
Mouse	Treg细胞群检测	CD4-FITC	FITC-30001
		CD25-PE	PE-30017
		FOXP3-APC	APC-30055