亲爱的科研小伙伴们,你是否曾在流式细胞术的实验中,为如何找到最佳的抗体用量和抗体浓度而苦恼?今天,就让我们一起揭开抗体滴定的神秘面纱,让你的流式分析更加精准高效!
1.什么是抗体滴定?
抗体滴定,是流式细胞术中的一项关键步骤。它通过逐步稀释抗体,找到既能有效结合目标抗原,又能避免非特异性染色的最佳浓度。
一般抗体供应商都会推荐抗体使用量, 如菲恩生物包装抗体。但为了达到最好实验效果及节省抗体,我们则需要自己做滴定,尤其在多指标流式检测实验中,抗体滴定就更加重要了。
2.为什么需要抗体滴定?
提升信噪比:最佳抗体浓度能最大化信号与噪声的比例,让你的数据更加清晰可靠。
节约成本:避免使用过量抗体,减少实验成本,同时降低样本自发荧光。
优化实验效果:不同实验条件(如细胞类型、实验方案、温度等)下,最佳抗体浓度可能不同,滴定确保每次实验都能达到最佳状态。
3.抗体滴定的步骤
准备抗体稀释液:根据厂家推荐的起始浓度,进行倍比稀释,通常设置多个浓度梯度。
细胞处理:将待测细胞与稀释后的抗体孵育,确保抗体充分结合到细胞表面。
洗涤与重悬:去除未结合的抗体,减少背景干扰。
流式检测:使用流式细胞仪检测各浓度下的荧光信号,记录数据。
数据分析:计算染色指数(SI),选择最佳抗体浓度。
4.数据分析
染色指数(SI):衡量阳性细胞群和阴性细胞群分离程度的指标,SI越大,分离效果越佳。
染色指数(SI)计算公式
选择SI最大时,对应的染色浓度作为最佳抗体浓度。
5.注意细节
1)关于全阳的细胞的滴定,可以在样本染色后加入未染色的细胞;
2)对于CD3、CD4、CD8这类分群明显且间隔非常开的指标,只做细胞性质确定设门用的时候,可不进行滴定,只滴定那些需要分析比例或MFI的指标;
3)对于表达量比较少的稀有细胞群体,在染色时,可加入该群细胞的父级细胞群的抗体;
4)如果样本中有大量的死细胞,在滴定过程中,要先加入死活染料区分死活,细胞表达Fc受体时,需要加Fc受体阻断剂。
5) 在一定的细胞密度范围内,抗体的染色指数只与抗体的浓度有关,与细胞密度无关。比如染色体系不变,细胞增加10倍,可以不用增加抗体浓度。